Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном

Введение

Разработка лекарственных препаратов направленного действия является приоритетной задачей современных молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины. В настоящее время существует большое количество работ, отражающих различные подходы для решения этой задачи. По ряду причин наиболее перспективным является подход, основанный на выборе в качестве мишени мРНК патогенного белка и использование свойства комплементарности при взаимодействии нуклеиновых кислот друг с другом. На сегодняшний день работы ведутся в трёх направлениях:

-       антисмысловые олигонуклеотиды;

-       рибозимы и ДНКзимы;

-       siRNA и miRNA.

В основе этих методов лежит использование коротких молекул нуклеиновых кислот (17 - 70 н.) с последовательностью, частично или полностью комплементарной участку мРНК - мишени. Общие принципы действия таких агентов объединяют их и в области возникающих проблем, среди которых наиболее острыми являются доставка в клетку, устойчивость к действию нуклеаз и эффективность взаимодействия с мРНК-мишенью. Химические модификации НК-агентов помогают частично или полностью решить многие из этих проблем и повысить эффективность действия агентов.

Изучение механизмов подавления экспрессии гена, используя комплиментарные взаимодействия требует использования методов анализа, позволяющих однозначно определить антисмысловое действие олигонуклеотидов.

Целью настоящей работы является отработка метода подавления экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном.

• Модификации антисмысловых олигонуклеотидов (Литературный обзор)
• Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов
• Модификации антисмысловых олигонуклеотидов
• Модификации фосфатной группы
• Модификации остатка сахара
• Модификации азотистых оснований
• Присоединение объёмных заместителей
• Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени
• Реактивы, используемые в работе
• Олигонуклеотиды, использовавшиеся в работе
• Буферные растворы, использовавшиеся в работе
• Разделение олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ
• Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в денатурирующих условиях
• Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле
• Приготовление цитавлоновых солей олигонуклеотидов
• Получение биспиренилного производного олигонуклеотида
• Выделение суммарной РНК из клеток
• Выделение суммарной РНК методом хлороформ-фенольной экстракции
• Выделение суммарной РНК с помощью набора «Gen Elute™ Mammalian Total RNA Kit» фирмы «Sigma»
• Получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции
• Проведение полимеразной цепной реакции
• Сравнение эффективности амплификации при использовании пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6
• Подбор оптимальных температуры отжига и концентрации хлорида магния
• Подбор оптимальных концентраций дезоксинуклеозидтрифосфатов и праймеров
• Результаты и обсуждения
• Синтез пиренильных производных олигодезоксинуклеотидов
• Сравнение эффективности выделения РНК из клеток методом хлороформ-фенольной экстракции и с помощью набора Gen Elute™ Mammalian Total RNA Kit» фирмы «Sigma»
• Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP