Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Присоединение объёмных заместителей

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Присоединение объёмных заместителей

Страница 1

Способность проникать внутрь клетки, минуя клеточную мембрану, - одно из качеств, которое должно присутствовать у эффективного антисмыслового олигонуклеотида. Большинство описанных выше модификаций нуклеотидов в составе ODN не оказывают значительного влияния на транспорт ODN через клеточную мембрану. Существует несколько путей проникновения молекул через плазмалемму, но для ODN важны два: диффузный, или не рецептор-опосредованный, и рецептор-опосредованный. Транспорт по первому варианту затрудняется суммарным отрицательным зарядом ODN и их гидрофильностью. Использование второго пути ограничено недостаточными данными о поверхностных белках мембраны клеток, отвечающих за транспорт нуклеиновых кислот в клетку. Создание конъюгатов ODN с различными химическими группами способствует повышению эффективности транспорта по тому или иному пути в зависимости от типа химической группы и места её присоединения к ODN. На рисунке 9 представлены варианты линкеров, которые используются при получении конъюгатов. Лиганды можно присоединять к азотистым основаниям, концевым фосфатам, фосфодиэфирным (или аналогичным им) связям, а также остаткам сахара. Некоторые типы химических групп позволяют также визуализировать компартментализацию путём детекции флуоресценции. модификация олигонуклеотид антисмысловый реакция

Рис.9. Примеры линкеров для присоединения лигандов.

Частичная и даже полная нейтрализация отрицательного заряда ODN не оказывает существенного эффекта на способность ODN к самопроизвольному транспорту в клетку. Присоединение различных объёмных гидрофобных лигандов, в частности, тех, что изображены на рисунке 9, облегчает транспорт ODN через мембрану.

Рис.10. Примеры липофильных лигандов.

Хорошо изучены конъюгаты с холестеролом [3,4,24,25]. Механизм, улучшающий проникновение в клетку за счёт присоединения холестерола, ещё не до конца ясен, хотя, предполагается рецептор-опосредованное включение липопротеидов [25]. Холестероловые конъюгаты образуют мицеллы, что облегчает их транспорт внутрь клетки. Присоединяют остаток холестерола обычно по концевым 5’- и 3’-фосфатам, причём 3’-монохолестерилолигонуклеотиды более эффективны по сравнению с 5’-монохолестерилолигонуклеотиды, а самыми действенными являются 5’,3’-бисхолестерилолигонуклеотиды. К примеру, через 6 мин после инъекции в кровь мыши уровень в тканях 3’-мономодифицированных фосфоротиоатиов был в 4 раза, а 5’-моно- и 3’,5’-бисмодифицированных - в 7 раз выше по сравнению с немодифицированными фосфоротиоатами [27].

Используют мономеры с 5’- или/и 3’-холестерилзамещённым фосфатом [2,24], олигонуклеотиды с лигандом, конъюгированным с фосфодиэфирной связью перед 3’-концевым нуклеозидом [25], а также холестериловые дендримеры с остатком лизина в качестве линкера (см. рис. 11) [23].

Рис.11. Неразветвлённые и разветвлённые конъюгаты с холестеролом.

Олигонуклеотиды, конъюгированные с другими гидрофобными молекулами (адамантан, пирен, эйкозановая кислота и др.), были синтезированы и сравнены с холестероловыми. Холестероловые конъюгаты показали оптимальную липофильность, а также хорошую способность к аккумуляции в печени [24].