Меню сайта

Последние новости

Причина отравления вод океана.

Американские ученые из штата Мичиган полагают, что в качестве главной причины отравления вод Мирового океана ртутью являются бактерии.

Секрет выживания лягушек.

Американским ученым удалось выяснить, как лягушкам удается продолжать жить даже после глубокой заморозки.

Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.




Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP
Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP
Страница 1

Была проведена ПЦР с использованием пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6, адресованных к гену EGFP. Положительным контролем (при использовании которого достоверно идёт амплификация) являлась пара праймеров AE-7,6, адресованных к гену AML-ETO. В качестве ДНК-матрицы использовали кДНК, полученную из клеток линии R1198 и содержащую ампликоны обоих генов. На рис. 20 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделеня в нём продуктов ПЦР.

EGFP-1,2 (дорожки 1,2), EGFP-3,2 (дорожки 3,4),

EGFP-5,6 (дорожки 5,6) и AE-7,6 (дорожки 7,8).

В качестве матрицы в 2,4,6,8 использовалась кДНК клеток линии R1198,

,3,5,7 - контрольные эксперименты (без добавлен7ия матрицы в РС).

При использовании ODN EGDP-1,2 в качестве пары праймеров амплификация практически не идёт, имеет место лишь такой артефакт, как «димеры праймеров» (см. рис…). Пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 сравнимы по эффективности амплификации.

Затем для каждой пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 подбирали оптимальную температуру отжига и концентрацию хлорида магния в реакционной смеси. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.2 настоящей работы. На рис. 21 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделения в нём продуктов ПЦР.

Наиболее интенсивно флюоресцируют бенды на дорожках 44 для EGFP-3,2 и на дорожках 36,37 для пары праймеров EGFP-5,6, что соответствует оптимальным условиям проведения ПЦР с использованием данных пар праймеров.

Таблица 9. Подбор оптимальной температуры отжига и концентрации катионов мангия в РС.

Пара праймеров

Дорожка

CMg2+, мМ

Тотжига, ºС

EGFP-3,2

44

5

61

EGFP-5,6

37

1,5

59,5

38

3

Наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд для пары праймеров EGFP-3,2 соответствует максимальной концентрации катионов магния в реакционной смеси и, как следствие, большому количеству неспецифических продуктов («шмер», см. рис…). В то же время, сравнимые с этим бендом по интенсивности флюоресценции бенды дорожек 36 и 37, соответсвтующие продуктам ПЦР с использованием пары праймеров EGFP-5,6, характеризуются меньшим количеством неспецифических продуктов. Условия реакции, в которых получен продукт ПЦР, обнаруженный на дорожке 36, являются наиболее подходящими для выявления EGFP в образцах. Эту пару праймеров в дальнейшем мы и использовали для дальнейшей оптимизации условий проведения ПЦР.

Далее были подобраны оптимальные концертрации праймеров EGFP-5 и EGFP-6 и дезоксинуклеозидтрифосфатов в указанных выше условиях: температура отжига 59,5 ºС, а концентрация катионов магния в реакционной смеси 1,5 мМ. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.3 настоящей работы. На рис. 22 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после проведения в нём разделения продуктов ПЦР.

При максимальной концентрации (1 мМ) dNTP наблюдалось большое количество образующихся неспецифических продуктов при почти полном отсутствии основного. Интерес представляют условия «8» (наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд) и «4» (второй по интенсивности), т.е.:

Таблица 9. Подбор оптимальной концентрации праймеров и dNTP в РС.

Дорожка

Спраймера, мкМ

СdNTP, мкМ

«8»

0,5

250

«4»

0,3

50

Условия «4» более предпочтительны ввиду меньшего количества неспецифических продуктов, а также меньшего расхода реагентов.

Таким образом, оптимальные условия для обнаружения EGFP методом ОТ-ПЦР можно просуммировать в табл. 9.

Страницы: 1 2

Смотрите также

Эколого-биологическая характеристика северного оленя на острове Сахалин
ВВЕДЕНИЕ Дикий северный олень Сахалина представлен наиболее крупной, ценной в хозяйственном отношении, но слабо изученной формой Rangifer tarandus phylarhus. В XIX - начале XX вв. ...

Острое и хроническое отравление алкоголем, его влияние на адаптивные процессы организма
Введение Алкогольные напитки - это напитки, содержащие этанол (этиловый спирт, алкоголь). В нашей стране ежегодно употребляется до 9,67 литра абсолютного алкоголя на душу населени ...

Особенности роста и плодоношения сортов алычи
Введение алыча растение сорт Родина алычи - Крым, Балканы, Иран, Малая и Средняя Азия, т.е. районы с засушливым и жарким климатом, чем и объясняются засухоустойчивость и жаровыносливос ...