Меню сайта

Последние новости

Причина отравления вод океана.

Американские ученые из штата Мичиган полагают, что в качестве главной причины отравления вод Мирового океана ртутью являются бактерии.

Секрет выживания лягушек.

Американским ученым удалось выяснить, как лягушкам удается продолжать жить даже после глубокой заморозки.

Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.




Полимеразная цепная реакция (Дейвис, 1990)
Материалы по биологии и химии / Полиморфизмы промоторной области гена Fas / Полимеразная цепная реакция (Дейвис, 1990)
Страница 1

Для проведения ПЦР готовили необходимое количество реакционной смеси для анализа необходимого числа проб в пропорциях, представленных в таблице 1. Для устранения погрешности, вносимой дозаторами при смешивании микрообъемов, общую смесь готовили из расчета на одну пробу больше, чем необходимо.

Таблица 1 Состав реакционной смеси для проведения ПЦР

Количество проб

1

2

3

4

5

10XБуфер (мкл)

2,5

5

7,5

10

12,5

dNTP(мкл)

2

4

6

8

10

F-праймер (GR-20)(мкл)

0,5

1

1,5

2

2,5

Tag-pol(мкл)

0,5

1

1,5

2

2,5

2d H2O(мкл)

17

34

51

68

85

R-праймер (Fas-OF) (мкл)

0,5

1

1,5

2

2,5

Смесь тщательно перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин.

В маркированные пробирки объемом 0.5 мл вносили по 23 мкл полученной реакционной смеси и по 2 мкл ДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Компоненты перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), смесь кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Для предотвращения испарения жидкости реакционную смесь покрывали двумя каплями минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе Fas Hot Start.

Условия инкубации реакционной смеси в амплификаторе «Терцик»:

для однонуклеотидного полиморфизма Fas -670 (A/G):

ºС - 30с

65ºС - 30с 45 циклов

72ºС - 40с

для однонуклеотидного полиморфизма Fas -1377 (A/G):

ºС - 30с

67,5ºС - 40с 45 циклов

72ºС - 30с

Для выявления полиморфизмов были использованы праймеры, нуклеотидная последовательность которых показана в таблицах 2 и 3. Также указана первичная структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas (таблица 4).

Таблица 2 Структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas, содержащего олигонуклеотидный полиморфизм Fas-670A\G

Праймеры

Нуклеотидная последовательность (5´-3´)

Fas ОНП F (A)

5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgA-3'

Fas ОНП F(G) alt

5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgg -3'

Fas ОНП R

5'-TggCATgCTCACTTCAggTg -3'

Таблица 3 Структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas, содержащего олигонуклеотидный полиморфизм Fas-1377A\G

ПраймерыНуклеотидная последовательность (5´-3´)

Fas ОНП 1377 F A)

5'-TgTgTgCACAAggCTggCACA -3'

Fas ОНП 1377 F(G)

5'-TgTgTgCACAAggCTggCACg -3'

Fas ОНП R

5'-TCTgCACCTCACTCTgCAACCT -3'

Страницы: 1 2

Смотрите также

Клеточный иммунный ответ
Введение Клеточный иммунный ответ (cellular immune response) [лат. immunis - свободный, избавленный от чего-либо] - иммунный ответ организма на появление антигенов, осуществляемый Т- ...

Демографическая теория Капицы
Введение Сергей Петрович Капица (14 февраля 1928, Кембридж - 14 августа 2012, Москва) - советский и российский учёный-физик, телеведущий, главный редактор журнала "В мире науки&q ...

Фенетическая структура земноводных местообитаний месторождений песка города Гомеля
Введение Земноводные занимают особое место среди других животных, так как представляют собой первых и наиболее просто организованных наземных позвоночных. Современные земноводные прин ...